學術進展

林金星教授團隊在植物膜蛋白動態計算方面發表高質量綜述論文

[发布日期:2018-04-09 点击数: ]

近日,北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心和生物学院林金星教授受邀在植物学权威学术期刊Annual Review of Plant Biology撰写题为 “Exploring the Spatiotemporal Organization of Membrane Proteins in Living Plant Cells”的综述文章 (IF=22.8),对在活体状态下植物膜蛋白动态、聚合状态及蛋白互作的单分子分析技术进行了总结,对这些单分子分析技术在植物生物学中的应用进行了深入探讨,并提出了有效的分析方法。

植物膜蛋白在物质转运和信号转导过程中发挥重要作用,但在活体条件下研究和分析膜蛋白的动态过程、分子间相互作用则非常困难。林金星教授研究团队率先建立了适合于植物活细胞观察的单分子分析平台,实现了在体、原位条件下膜蛋白聚合状态以及蛋白互作的纳米和毫秒级的实时动态检测。十多年来,通过单分子技术相继对植物中的PIP2;1 (Li et al., Plant Cell, 2011), Flot1 (Li et al., Plant Cell, 2012), AMT1;3 (Wang et al., PNAS, 2013), AP2 σ (Fan et al., Development, 2013), Phot1 (Wan et al., Plant Cell, 2014), RbohD (Hao et al., Plant Cell, 2014), BRI1 (Wang et al., Molecular Plant, 2015) 等膜蛋白的扩散和驻留时间等动态参数进行了检测和分析。此外, 还通过优化单分子技术,分析了活体状态下膜蛋白的聚合状态 (Wang et al., Nature Protocols, 2015),并建立了一些重要细胞器膜蛋白的单分子检测技术方法 (Lv et al., Molecular Plant, 2017)。在过去这些研究的基础上,该综述着重分四部分评述了植物膜蛋白单分子研究技术,包括标记技术、单分子成像技术、膜蛋白聚合体和互作的动态计算方法,以及这些技术在植物生物学领域的应用。

由于單個分子的熒光很弱,並且容易受到背景噪音的幹擾,因此要實現單分子成像,對膜蛋白進行有效標記至關重要。該綜述的第一部分除了介紹常規的標記方法,譬如小分子染料和納米熒光顆粒標記(量子點QD)等技術外,還重點敘述了熒光蛋白的標記(如GFP、mCherry、DsRed-E5、光激活蛋白PA-GFP和Dronpa),以及它們在實際應用中需要注意的問題。

第二部分闡述了標記後蛋白的單分子追蹤和成像技術,包括激光共聚焦顯微鏡、超高分辨顯微鏡和寬場顯微鏡等。雖然常規的共聚焦顯微鏡的分辨率不能達到單分子檢測要求,但如果配置高靈敏度的檢測器,結合相應的分析系統,譬如熒光相關光譜(FCS)、熒光互相關光譜(FCCS)和熒光能量共振偏移(FRET)技術等,也可以實現對單分子的追蹤、動態分析以及膜蛋白狀態的檢測。該綜述除了介紹2014年諾貝爾化學獎授予的超分辨顯微術(STED、STORM、PALM等)以外,重點介紹了適合于植物細胞膜蛋白分析的可變角度-全內反射熒光顯微鏡(VA-TIRFM)的原理及其應用。

综述的第三部分详细介绍了在标记和成像基础上,测定膜蛋白聚合状态和动力学特征的主要方法:(1)通过荧光强度的分析技术,包括FIDA、PCH、SpIDA技术;(2)通过荧光漂白的分析技术,包括smSubunit-counting和smFRAP技术;(3)通过荧光涨落及荧光共振能量转移的分析技术,包括FCS/FCCS、FRET-FLIM技术;(4)通过蛋白共定位和相互作用的分析技术,包括单分子水平的蛋白接近指数分析技术(smPPI)和单分子水平的pull-down 技术。

圖1植物細胞中膜蛋白聚合狀態的動態計算技術模式圖

 

綜述的最後一部分簡要敘述了在信號傳導過程中,單分子技術用于檢測膜蛋白聚合與活化狀態、動態變化與膜筏關系、動力學特征與細胞骨架關系,以及不同環境條件下膜蛋白密度、駐留時間、胞吞途徑和轉運速率、細胞骨架和細胞壁對膜蛋白聚合體形成的動態調控等方面的應用,爲植物膜蛋白的研究提供了新思路。

該綜述已于4月6日在線發表(https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042817-040233)。林金星教授爲論文的通訊作者,該團隊成員、現爲揚州大學副教授王莉爲論文的第一作者,團隊成員薛轶群、邢晶晶和宋凱博士爲論文的其他作者。該論文得到了北京林木分子設計育種高精尖創新中心和國家自然科學基金重點項目的資助。